Depuis les hypothèses d'Allen et al⁷¹, l'apparition de l'oxygène singulet dans les milieux biologiques fait toujours l'objet de controverses, souvent acharnées, même au début du 3^ième millénaire. Pour étudier une molécule aussi fugace, il faut des moyens techniques directs qui ne sont que rarement applicables in vivo.  Nous ne citerons ici que les procédés qui sont utilisables pour essayer de démontrer la réalité d'une formation de ¹Δ_g au sein des cellules.

B.1. Méthodes d'étude
La mise en évidence de l'oxygène singulet in vivo est extrêmement délicate et nécessite le recours à différentes techniques de luminescence, à des piègeurs plus ou moins spécifiques, à l'eau deutérée, etc... L'accumulation de présomptions produite par l'usage de ces divers moyens pourra plaider en faveur d'une intervention de ¹Δ_g.

B.1.1. Chimioluminescence

B.1.1.a. Discussion générale de la signification analytique de la CL

Généré en système biologique complexe, l'oxygène singulet peut réagir avec certains composés dont les produit de réaction peuvent être activés et émettre une luminescence propre présentant diverses longueurs d'onde⁷². Ainsi peuvent s'expliquer les résultats de Nakano et al.⁷³ montrant au cours d'une expérience les deux raies considérées comme caractéristiques (fig. 17) de ¹Δ_g, mais aussi 3 autres raies de plus courte longueur d'onde (consulter B.2.1.3 ). Dans le phagosome, cette vacuole cytoplasmique créée par la phagocytose, une série de réactions simultanée se produisent, émettant une luminescence rouge (voir B.2.2.3).
Une chimioluminescence observée in vivo n'est pas nécessairement due à l'oxygène singulet, même si elle est rouge : par exemple, la tyrosine excitée émet dans le rouge (B.2.2.3) et les radicaux carbonyles sont eux aussi émetteurs⁷⁴. 

B.1.1.b. Emission à 1260 nm (fig. 16)
La raie à 1260 nm est très spécifique, mais très faible (A.4.2.a.) et donne surtout une indication qualitative. In vivo, les mesures deviennent particulièrement difficiles, car la durée d'existence de ¹Δ_g tombe de 3 msec, en milieu aqueux non vivant, à 0,1-0,2 msec in vivo^75,76, car, in vivo, ¹Δ_g réagit plus rapidement avec les molécules du milieu que le temps qu'il lui faut pour se désexciter: dans un milieu cellulaire saturé en O₂ (condition optimale), la vitesse de formation de ¹Δ_g a été estimée être de 5 à 10 fois plus lente que celle de sa décroissance^77,78; en présence de biomolécules, le temps de survie de ¹Δ_g décroît spectaculairement de ± 3 microsecondes à environ 100 nanosecondes⁷⁹. La détection et la mesure de ¹Δ_g en milieux biologiques nécessitent un appareillage de détection perfectionné. Krasnovsky⁸⁰ a passé en revue les divers appareillages conçus pour réaliser ces performances.
En 1981, Khan construisit le premier appareillage de détection ultrasensible comprenant une diode au germanium refoidie à l'azote liquide⁸¹. La détection spécifique ultrasensible de l'oxygène singulet se fait au moyen d'une photodiode au germanium (souvent  le modèle EO-817P de North Coast, Japan) refroidie par effet Peltier ou à l'azote liquide. Spectrogon vend un filtre interférentiel centré sur 1270 nm. Andover Corp. fournit un filtre "cut-off" ne laissant passer que les longueurs d'onde supérieures à 995 mm. En 2000, Sharman et al. écrivaient, en se basant sur la très courte durée d'existence de ¹Δ_g : " ...direct evidence (of ¹Δ_g) has been illusive"⁷⁸. Mais très récemment, Niedre et al (2002) ont proposé une méthode de détection de ¹Δ_g "time-resolved"⁷⁹.
Enfin, signalons les progrès réalisés dans le domaine des PEBBLE (Probes Encapsulated By Biologically Localized Embedding ) qui sont des "nanosenseurs" munis, dans le cas des mesures in vivo de ¹Δ_g , de nano-optodes⁸².

B.1.1.c. Emissions dans le rouge (fig. 17)
Les 2 raies visibles de 634 et 703 nm sont de moins en moins considérées comme preuve d'apparition de ¹Δ_g, par exemple au cours de la phagocytose (B.2.2.3).

B.1.1.d. La tetra-tert-butylphthalocyanine
Elle capte l'énergie de la décroissance monomoléculaire de ¹Δ_g; elle pourrait être un élément de plus pour décider de la formation d'oxygène singulet dans un système³⁶.

 B.1.2. Effet amplificateur de D₂O
 
Nous avons vu plus haut (A.5.1) le mécanisme de ralentissement de la décroissance de ¹Δ_g par l'eau deutérée, ce qui amplifie l'intensité de la luminescence ou d'une réaction d'oxydation.
L'utilisation d'eau deutérée pour confirmer qu'un phénomène dépend de l'oxygène singulet (une chimioluminescence, par exemple) est devenue courante depuis les travaux de Merkel⁸³. D₂O fait durer l'existence de ¹Δ_g et amplifie les phénomènes de luminescence, notamment monomoléculaire. Hawco et al.⁸⁴ ont montré que D₂O accélère la décomposition des lipoperoxydes de l'acide linoléique, avec augmentation de l'ultraweak chimioluminescence (uwCL).

B.1.3. Quencheurs et piègeurs spécifiques  

L'oxygène singulet réagit avec des molécules susceptibles d'excitation: ce sont les piègeurs (quenchers) d'¹Δ_g. Leur présence dans un milieu interdit toute réaction de ¹Δ_g avec d'autres substances qu'elles-mêmes. Les premiers travaux tentant de mettre en évidence la présence d'¹Δ_g se sont basés sur l'attaque de quenchers réputés spécifiques et oxydés selon une réaction attribuée à l'oxygène singulet.
En 1964, Corey et Taylor⁸⁵ ont découvert que le diphénylanthracène (DPA) (fig. 32) réagit spécifiquement et rapidement avec ¹Δ_g pour former un endoperoxyde stable dont le spectre présente un pic d'absorption à 355 nm⁸⁶.

Fig. 32 : 9,10-diphénylanthracène ou DPA (référ. 87). 

La liste des piègeurs d'oxygène singulet est longue: nous étudions ici les principaux qui ont été utilisés en biochimie.          

B.1.3.a. Le cis-β-carotène⁸. Sous l'apport énergétique de ¹Δ_g, il passe à la forme trans, au cours d'une réaction EET exothermique (Fig. 33) [Voir A.5.1.c. Quenching par transfert de l'énergie électronique]. 

             15-15'-β-cis-carotène  +  ¹Δ_g  ===> all-trans-β-carotène + ³O₂ + chaleur (XIII)

Le carotène est un puissant "quencheur" d'oxygène singulet.

 
    
Fig. 33 : L'énergie libérée par ¹Δ_g (22kCal) est utilisée par la molécule de β-cis-carotène pour acquérir la forme β-trans-carotène⁸⁸ .

Le β-carotène, à la molarité de 10^-4M, inhibe 95% des réactions de ¹Δ_g avec une molécule organique⁸⁹. Une molécule de β-carotène suffit pour pièger au moins 100 molécules de ¹Δ_g⁸⁹.  Ces faits sont à rapprocher des observations de Krinsky⁹⁰ : les polynucléaires humains tuent beaucoup plus facilement les sarcines non porteuses d'un pigment caroténoïde que les souches mutantes en contenant.
D'autres caroténoïdes possèdent ces propriétés⁹¹.

B.1.3.b. Le diphényl-iso-benzofuranne ou DPBF⁹². Ce composé réagit lentement avec l'oxygène triplet, d'ou la nécessité de préparer ses solutions extemporanément. Celles-ci présentent une fluorescence vert-bleuâtre; l'absorption caractéristique se situe vers 410 nm. La perte de fluorescence permet de doser l'apparition d'espèces oxydantes, telles que les radicaux ROO^•, formées dans un milieu et non exclusivement le ¹Δ_g⁹³. L'utilisation dans un milieu aqueux nécessite le recours au polyéthylène glycol 400. Il peut se dimériser en perdant sa fluorescence caractéristique (cause d'artefact dans la mesure des oxydants). Le DPBF ne peut être considéré comme un "quencheur" physique puisqu'il disparaît en cours de réaction (fig. 34). Sa cinétique de réaction avec ¹Δ_g a été particulièrement étudiée par Matheson⁹⁴ et Merkel⁹⁵ (fig. 34 et 35). Il a été souvent employé dans des réactions de peroxydation, pour déterminer l'importance de son rôle dans ces phénomènes^96-105.
Néanmoins, dès 1975, on s'aperçut que tout initiateur de radicaux libres, dans un milieu donné, peut amorcer une autoxydation du DPBF dissous¹⁰⁶. Les résultats obtenus avec ce réactif doivent donc être interprétés avec la plus grande prudence.

Fig. 34 : Réaction du DPBF avec l'oxygène singulet (d'après Howard,1975, réf 93).

Fig. 35 : Séparation par du DPBF (DPF) d'avec les deux isomères de la dibenzophénone
(trans- et cis-DBE).

B.1.3.c. Le 1,4-diazabicyclo(2,2,2)octane ou DABCO^107,108 (fig. 36)

Fig. 36 : Formule du DABCO.

II s'agit d'un composé à effet piègeur douteux, spécifiquement parlant. En effet, s'il manifeste des propriétés de ¹Δ_g-scavenger évidentes dans certaines réactions, il favorise au contraire l'attaque de certains composés par l'oxygène singulet : c'est le cas dans la réaction de ¹Δ_g avec l'acide α-cétocarboxylique¹⁰⁹, dont le DABCO augmente le rendement au lieu de le freiner. Le DABCO stimule également la chimioluminescence attribuée à la formation d'oxygène singulet dans certaines décompositions  d'hydroperoxydes, alors que le DPBF l'inhibe⁸⁴. II stimule aussi la chimioluminescence de ¹Δ_g dimolaire produit au cours de la réaction de Mallet^39,110 qui est, elle aussi, "quenchée" par le DPBF. Le DABCO, pourtant, est tonjours considéré comme un piègeur spécifique de ¹Δ_g et plusieurs auteurs l'ont employé pour nier la présence de ¹Δ_g dans les milieux biologiques : nous estimons que les arguments que nous venons d'exposer doivent inciter à plus de prudence au cours de l'utilisation de ce " ¹Δ_g-scavenger".                        

B.1.3.d. La tétraphenylcyciopentadienone¹¹¹

Fig. 38 : La réaction de la tétraphénylcyclopentadiènone avec ¹Δ_g forme un endoperoxyde.

B.1.3.e. L'acide lipoique¹¹²
ce composé peut passer très facilement à l'état oxydé. Il réagit facilement avec ¹Δ_g¹¹³.

Fig. 39 : Acide lipoïque. A : forme réduite;  B: forme oxydée.

B.1.3.f. Le diméthylfuranne^114,115
Ce piègeur semble être aussi spécifique que le DPBF; ¹Δ_g l'oxyde en 2-hydroxy-5-hydroperoxy-2,5-diméthylfuranne (fig. 40). Cependant, des doutes ont été émis quant à sa spécificité¹¹⁶.

Fig. 40 : Réaction du diméthylfuranne avec ¹Δ_g.

B.1.3.g. L'azide de sodium¹¹⁷

B.2. Possibilités de génération in vivo

Ce sont Allen et al.⁷¹ qui ont postulé, en 1972, la formation de ¹Δ_g au cours de la phagocytose (voir B.2.2.3).

B.2.1. Génération non enzymatique

B.2.1.1. La dismutation de l'anion superoxyde   
De l'oxygène singulet se forme-t-il au cours de la dismutation de l'anion superoxyde ? Voilà un sujet qui n'arrête pas de fournir matière à controverses. Arneson¹¹⁸ a proposé le schéma réactionnel suivant :
                                     2O₂^- + 2 H⁺ → H₂O₂ + ¹Δ_g    (XIV)

Cette hypothèse a été accueillie très favorablement et plusieurs équipes ont postulé son exactitude pour aller plus avant^{11,18,23,67,119,120,121}. Elle fut cependant niée par Poupko¹²².
Arneson¹¹⁸ avait proposé un deuxième schéma réactionnel, dérivant du premier : 

                                     O₂^- + ^•OH → OH^- + ¹Δ_g  (XV)

Les considérations d'Arneson étaient étayées par des expériences au cours desquelles des effets, attribués à ¹Δ_g, étaient atténués par la superoxyde-dismutase.
Thermodynamiquement, le premier mécanisme fut considéré d'abord comme possible, l'énergie dégagée couvrant facilement les 22 kCal séparant l'oxygène triplet de ¹Δ_g, mais 3 ans après, Koppenol¹²³ le contestait.
Le 2^ième mécanisme est encore plus exothermique et permettrait d'atteindre un niveau d'énergie suffisant pour former ¹Δ_g^120,124,125.

 La production de ¹Δ_g pourrait survenir en présence d'un accepteur d'électron Acc :
                        O₂^-  + Acc → ¹Δ_g + Acc^- (XVI)
 Il y aurait transfert d'e-.

Se basant sur ces considérations, des auteurs^96,126 ont affirmé que la toxicité de l'anion superoxyde s'expliquait par sa transformation en ¹Δ_g et ont essayé de supprimer cette soi-disante production de ¹Δ_g par utilisation de superoxyde-dismutase, proposant cette enzyme comme piègeur de l'oxygène singulet. Outre la SOD, Kellog et Fridovich¹¹⁴ ont suggéré que la catalase inhiberait la production de ¹Δ_g ; ces travaux étaient basés sur l'étude des lipoperoxydations induites par le système hypoxanthine/xanthine-oxydase, inhibé par la SOD et la catalase; mais en aucune façon ces auteurs n'ont pu établir une génération d'oxygène singulet durant cette réaction enzymatique. King et al.¹²⁷ ont démontré que, bien au contraire, le système  hypoxanthine/xanthine-oxydase ne produit pas d'¹Δ_g.
Les preuves expérimentales de cette genèse d'¹Δ_g ont été fournies, soit par l'utilisation d'agents piègeurs présumés spécifiques de ¹Δ_g (tels que le DPBF), soit par la détection d'une chimioluminescence que l'on a associée automatiquement à une formation de ¹Δ_g.
Le DPBF peut donner des résultats douteux (voir B.1.3.b.). La chimioluminescence n'est pas forcémentune preuve d'apparition de ¹Δ_g (voir B.1.3.b.), sauf si elle comprend la longueur d'onde λ = 1270nm. La formation d'¹Δ_g à partir d'une dismutation d'O₂^- a cependant été promptement mise en doute^122,128.

Relançant la controverse, Khan¹²⁹ a précisé les conditions au cours desquelles, affirme-t-il, ¹Δ_g peut être produit à partir de la dismutation de O₂^-; une des causes principales faisant obstacle à cette génération réside dans le quenching de ¹Δ_g par O₂^- à hautes concentrations.
L'équation suivante a été proposée,

                         O₂^- + ¹Δ_g → O₂^- + ³O₂  (XVII)

permettant de supposer que la concentration en anion superoxyde, dans les systèmes biologiques, était trop faible pour que cet effet piègeur d'oxygène singulet soit efficace¹³⁰. Pour ces auteurs, la genèse de ¹Δ_g par dismutation de O₂^- est donc possible dans les milieux vivants. 

B.2.1.2. Les réactions de décomposition non enzymatiques de H₂O₂
Comme dans la réaction de Mallet, un processus de transfert concerté de 2 électrons pourrait se produire au cours des réactions :

H₂O₂ + OH^- → HOO^- + H₂O    (XVIIIa)

H₂O₂ + HOO^- → H₂O + O₂ (¹Δ_g + ³O₂)   (XVIIIb)
_________________________________           
2H₂O₂ → H₂O + O₂ (¹Δ_g + ³O₂)   (XVIII)

Cette "disproportionated reaction" est catalysée par le cholestérol dispersé dans le stéarate de Na en système aqueux. Les 2 espèces oxygénées seraient obtenues dans le rapport ¹Δ_g/³O₂ = 1/3. Ce phénomène ne se produirait pas au cours de l'attaque de H₂O₂ par la catalase ou par la peroxydase du raifort¹³¹. Ces résultats mettent en doute des travaux antérieurs¹³².

B.2.1.3. La décomposition des hydroperoxydes
Des 1957, Russell¹³³ supposa que 2 radicaux peroxydes secondaires peuvent former des ponts tétroxydes par réaction "headhead". C'est le cas de deux chaînes d'acides gras insaturés fixés parallèlement dans une même molécule de phospholipide ou de glycéride¹³⁴.
Selon l'Hypothese de Howard et Ingold¹³², l'O₂ formé serait ¹Δ_g. Une première confirmation fut apportée par résonance paramagnétique électronique¹³⁵. Les calculs de Ingold¹³⁶ confirment que le mécanisme le plus probable, à température ordinaire, est celui de Russell¹³³.

La confirmation expérimentale des réactions "head-head" a été apportée par marquage isotopique¹³⁷. Cependant, d'autres mécanismes ont été proposés par Lindsay¹³⁸. La réaction "cage" des radicaux alkoxy aboutit à une dimérisation puis une scission β-, parce que la diffusion à partir des cages est induite par la soustraction d'un H. Par une autre voie, la formation d'oxygène singulet, au cours de la réaction de Russell, allait être démontrée, prouvant en même temps la validité biologique de ce schéma.

Howes et Steele¹³⁹ ont attribué à ¹Δ_g la chimioluminescence émise durant la peroxydation lipidique "NADPH-mediated" par les microsomes hépatiques. Nakano et al.¹³⁴ ont confirmé cette hypothèse en montrant que la superoxyde dismutase ne quenche pas la chimioluminescence. Ces auteurs affirmèrent avoir mis spectroscopiquement en évidence une formation de ¹Δ_g au cours de "self-reactions" entre radicaux peroxy, in vitro, en présence d'ions cériques. En réalité, ils ont observé l'émission de nombreuses raies à 5200, 5780, 5900, 6350 et 7035 ångströms. Seules les deux dernières raies pouvaient témoigner d'une presence de ¹Δ_g. Ces deux raies, par la suite, ne seront plus considérées comme preuves décisives de l'oxygène singulet. Les auteurs estiment que c'est au cours de réactions "head-head", par condensation de radicaux peroxy, que se produit l'oxygène singulet, par self-reaction (voir le schéma de Russell, fig. 41). Nakano et al. oublient malheureusement de citer, comme devanciers, les travaux de Russell.

Dans les systèmes biologiques, riches en acides gras non saturés, la production de l'oxygène singulet serait assurée par des "self-reactions" de sec-peroxy radicals, catalysées par le NADPH, au niveau des microsomes; cette hypothèse est confirmée par des travaux biologiques récents, tels la mise en évidence d'une chimioluminescence "NADPH-mediated "durant la phagocytose¹⁴⁰.

Allen et al.⁷¹ ont mesuré la décomposition rapide d'hydroperoxydes d'acide linoléique en présence d'hèmes et d'hémoprotéines en une série de composés divers, dus a l'action d'espèces oxygénées radicalaires. Hawco et al.⁸⁴ ont montré que la "self- decomposition" du linoléate, obtenue par Nakano¹³⁴ en présence de chlorure de cérium, peut se produire en présence d'hématine ou de methémoglobine, à pH 7,5. Un dégagement d'oxygène est enregistré durant la première minute, en même temps qu'une chimioluminescence. Le rendement est plus élevé qu'avec le chlorure de cérium. Par une utilisation rationnelle des piègeurs d'oxygène singulet (voir B.1.3.), ces auteurs ont rendu très plausible l'hypothèse d'un dégagement de ¹Δ_g au cours de cette réaction.

D'autres arguments ont été récemment fournis pour étayer l'hypothèse d'une génération de ¹Δ_g à partir de lipoperoxydations:

a. Production de ¹Δ_g par les systèmes enzymatiques "lipoxydase-like": Chan¹¹¹ observe une co-oxygénation du DPBF au cours de l'incubation de linoléate avec la lipoxygénase; utilisant D₂O comme catalyseur, il conclut que le blanchîment du cytochrome c par les lipoxygénases est dû à ¹Δ_g.

b. Ces travaux seront cependant sérieusement infirmés par King et al.¹²⁷ qui ont affirmé qu'une formation de ¹Δ_g accompagne la peroxydation "NADPH-mediated" de lipides par les microsomes hépatiques, en presence de Fe³⁺: cette assertion repose sur la mise en évidence d'une co-oxygénation du DPBF durant la peroxydation.

c. Production de ¹Δ_g au cours de la biosynthèse des prostaglandines: des démonstrations en ont été fournies par la co-oxygénation du DPBF, in vitro, durant l'activité des PGsynthétases^141,142,143. Ce serait un système peroxydasique distinct qui produirait ¹Δ_g, en même temps que fonctionnerait la PG-synthétase¹⁴⁴.

B.2.1.4. Génération photochimique in vivo
Nous avons discuté plus haut des généralités de la production photochimique de ¹Δ_g (A.3.1).
Ses applications en médecine font l'objet du chapitre C.
     
Foote et Ching¹⁴⁵ ont souligné la forte réactivité de la bilirubine qui serait, pour eux, la substance la plus réactionnelle de l'environnement lipidique.
Dalton et Mc Auliffe¹⁴⁶ ont fait remarquer que la présence de protoporphyrine IX à l'état libre a été constatée, à la surface des tissus, dans les cas de porphyries humaines.

B.2.1.5. Action de l'ozone:
Elle est proposée par divers auteurs^31,147-150.
Kanowski et Sima¹⁵⁰, notamment, ont mis en évidence la formation d'oxygène singulet par réaction de l'ozone avec l'acide ascorbique, phénomène favorisé par la présence d'ascorbate oxydase, ce qui affaiblit la thèse d'une protection contre l'ozone par l'ascorbate, car il se produit une forme activée de l'oxygène au moins aussi toxique que l'ozone. Les mêmes auteurs ont démontré la libération de ¹Δ_g par réaction de O₃ avec diverses molécules organiques, dont l'acide urique et le glutathion réduit.        

B.2.2. Génération enzymatique

B.2.2.1. Activité de la lactoperoxydase^151,152
L'émission d'une luminescence d'intensité maximale à 1270 nm a été démontrée dans le système lactoperoxydase/H₂O₂/Br^-152.

La réaction suivante a été proposée
                        2H₂O₂  → H₂O + ¹Δ_g   (XIX)

L'effet de Br^- s'expliquerait comme suit:

            H₂O₂ + Br^- → OBr^- + H₂O  (lactoperoxydase)   (XX)

            OBr^- + H₂O₂ → H₂O + Br^- + ¹Δ_g   (XXI)                         

B.2.2.2. Activité de la chloroperoxydase
En 1966, Morris et Hager¹⁵³ isolèrent une peroxydase végétale contenant une ferriprotoporphyrine IX par molécule et qui, tout comme la myéloperoxydase, peut réduire H₂O₂, mais aussi utiliser Cl^- ou Br^- comme donneurs d'électrons, ce qui permet des halogénations enzymatiques. Utilisant son détecteur ultrasensible, Khan put montrer que durant l'activité de la chloroperoxydase, un pic lumineux était émis aux environs de 1300 nm¹⁵⁴. La même année, utilisant également un spectromètre sensible, Kanofsky et al. observèrent cette luminescence à 1268 nm¹⁵⁵.
Les deux groupes l'attribuèrent à la génération de ¹Δ_g, provenant de la réaction du substrat de la chloroperoxydase, H₂O₂, avec le produit formé, HOCl ou HOBr.

B.2.2.3. Activité de la myéloperoxydase (MPO) et phagocytose^37,156-162
On a longtemps pensé que c'est durant les cascades de réactions se produisant au cours de la phagocytose par les polynucléaires que l'on peut espérer avoir un maximum de chance d'observer la formation d'oxygène singulet in vivo. En 1972, Allen et al. émirent l'hypothèse d'une production de formes excitées de l'oxygène au cours de la phagocytose et, parmi celles-ci, d'oxygène singulet⁷¹. En 1973, Allen et Steele faisaient dépendre la production de ¹Δ_g de la MPO¹⁶³. 
Krinsky supposa, en 1974, que le puissant effet bactéricide des polynucléaires activés était dû à la formation d'oxygène singulet¹⁵⁶. Mais dès 1976, Cheson et al. ont montré que l'émission lumineuse émise dans le visible au cours de la décroissance de ¹Δ_g ne se retrouvait pas dans le spectre compliqué de la luminescence émise au cours de la phagocytose⁷².
En effet, ces éléments sont le siège d'une flambée respiratoire intense, produisant H₂O₂, lequel est le substrat de la myéloperoxydase existant dans ces cellules. De l'hypochlorite ClO^- est formé. Si des molécules de H₂O₂ rencontrent ClO^- néoformé, il se produira une réaction de Mallet avec dégagement de ¹Δ_g.
Ces réactions devraient avoir lieu dans le phagosome ou à l'extérieur des cellules productrices. Il ne semble donc pas qu'il y ait des obstacles structuraux à la rencontre des deux molécules génératrices d'oxygène singulet.
Une démonstration indirecte, peu spécifique, d'une production de ¹Δ_g durant la phagocytose fut fournie en 1977 par Rosen et Klebanoff¹⁵⁷ qui montrèrent :
            a) la conversion du DPBF en cis-DBE, en présence de myéloperoxydase;
            b) la stimulation de cette conversion par D₂O;
            c) l'inhibition de cette conversion par le β-carotène, la bilirubine, le DABCO et l'histidine.
Démonstrations in vitro en systèmes purifiés
Une démonstration spécifique in vitro de la production de ¹Δ_g durant l'activité in vitro de la myéloperoxydase (MPO + H₂O₂ + Br^-) , fut faite par Khan³⁷, grâce à l'appareillage spectroscopique décrit ci-dessus (B.1.1.b): la présence d'une raie à 1268 nanomètres était clairement mise en évidence.
Plus récemment,la même démonstration, utilisant une double diode au germanium, fut effectuée par Kiriyu et al.¹⁶¹, sur le système MPO + H₂O₂ + Cl^-, plus proche de celui opérant dans le phagosome des polynucléaires. Un pic de luminescence à1270 nm fut enregistré, avec une distribution spectrale similaire à celle provenant de la décroissance de ¹Δ_g.
Démonstrations in vivo
Mais les expériences visant à démontrer la formation de ¹Δ_g dans le phagosome par l'existence de son pic lumineux à 1268 nm ont échoué dans le cas des polynucléaires neutrophiles^164-167. Par contre, cette tentative a réussi dans le cas des polynucléaires éosinophiles^168,169. On peut aussi retenir les expériences sur PMNs en présence de 9,10-diphénylanthracène (DPA: voir ci-dessus) réalisées par Steinbeck et al.¹⁷⁰: le DPA était étalé sur des lamelles de verre ou couvrait des billes phagocytables. En extrayant au CHCl₃, le DPA et son endoperoxyde, considéré comme spécifique de l'attaque du DPA par l'oxygène singulet, cette équipe a augmenté les raisons de croire en la production de ¹Δ_g dans les phagosomes et dans le milieu extra-cellulaire. Sur la base de ces résultats, cette équipe a calculé que 19 % de l'oxygène consommé devenaient du ¹Δ_g.
Des travaux plus récents ont attribué la chimioluminescence rouge émise par les  neutrophiles activés à la tyrosine et à la bityrosine à des stades excités, mais non à la décroissance de ¹Δ_g (λ = 500, 530 & 570 nm)¹⁷¹. Toutefois, comme le conseillaient Hampton et al.¹⁶⁴ dans une revue sur les espèces oxygénées formées au cours de la phagocytose, ces travaux requièrent de nouvelles recherches.
Beaucoup moins convaincants sont les travaux réalisés par Razumovitch et al.¹⁶² qui ont utilisé la très peu spécifique chimioluminescence du luminol qui augmentait lors du traitement in vitro de la MPO par la néoptérine; ces auteurs en concluaient qu'il s'agissait d'une formation de ¹Δ_g, puisque le DABCO inhibait totalement cette luminescence (voir le caractère douteux de l'inhibition par le DABCO en B.1.3.c.).

B.2.2.4. Activité de la catalase 
De l'oxygène singulet se formerait au cours de l'activité de la catalase, dans certaines conditions^172,173,174; cependant, Porter et Ingraham ont contesté la justesse de ces observations¹⁷⁵. Jusqu'à plus amples investigations, la réaction: 

  (XXII)

doit être considérée comme purement théorique, car elle n'est prouvée par aucune démonstration directe d'existence de ¹Δ_g.

B.2.2.5 Génération par les oxygénases et les oxydases
Citons les travaux de Rosen et Klebanoff¹⁷⁶ qui avaient affirmé que la NADPH oxydase génère ¹Δ_g. Ces travaux n'ont pas été confirmés par spectrométrie.
Par contre, des publications récentes font état d'une production d'oxygène singulet par des cytochromes P450^177,178,179. Malheureusement, aucune démonstration directe par spectrométrie spécifique n'a été fournie par ces chercheurs.
Marnett et al. observèrent l'émission d'une luminescence rouge durant l'activité de la cyclooxygénase in vitro¹⁴¹. Cadenas et al. reprirent ces expériences en 1983, en analysant la luminescence rouge au moyen de filtres qui leur permirent d'affirmer que les rayonnements présentaient deux pics à 634 and 703 nm¹⁸⁰. Mais Kanofsky montra que cette luminescence rouge était un piège pour les chercheurs, car elle ne s'accompagnait pas de la radiation caractéristique à 1268 nm¹⁸¹ ; d'autres phénomènes que la décroissance de l'oxygène singulet peuvent produire une telle chimioluminescence.
Les lipoxygénases de soja émettent également, in vitro, durant l'attaque de l'acide linoléique, une luminescence caractéristique à 1268 nm¹⁸².

B.2.3. Conclusions (voir Kanofsky, réf. 166)

L'oxygène singulet est une forme de l'oxygène très réactionnelle, de très courte vie, qui oxyde très aisément une grande variété de molécules biologiques. La production biochimique de ¹Δ_g a été proposée comme agent contribuant aux effets destructeurs observés dans nombre de processus biologiques. Divers modèles de systèmes biochimiques ont été considérés comme producteurs de cette forme d'oxygène.
On propose notamment l'oxydation des halides ionisés (Cl^-, Br^-, I^-) catalysée par des peroxydases (exemple : la myéloperoxydase), l'oxydation de l'acide indole-3-acétique catalysée par une peroxydase végétale, l'oxydation des acides gras polyinsaturés à longue chaîne par les lipoxygénases et la décomposition d'hydroperoxydes en présence de bléomycine.
Mais une considération très importante doit être faite : les résultats obtenus à partir d'expériences menées in vitro ne peuvent être extrapolés sans de sérieuses analyses critiques aux systèmes biologiques.